任一平：液質技術在食品微量蛋白質定量中的應用

蛋白質作為人類機體的重要組成部分，是生命活動的主要承擔者。人們在日常生活中也習慣性的將蛋白質的攝入量作為健康飲食的重要指標。2018年6月23日，由國聯股份(832340)、食品安全與檢測傳媒事業部主辦的“2018年第十一屆中國食品安全檢測技術高峰論壇暨首屆新技術、新產品、新工藝及優秀工程師推薦評選活動”在杭州盛大召開。浙江清華長三角研究院國家食品安全風險評估中心總工程師任一平做了題為《液質技術在食品微量蛋白質定量中的應用》的報告，就高效液相色譜-質譜聯用技術在微量食品蛋白質檢測中的創新性運用做了詳細的闡述。

在報告中，任一平介紹到，目前學界對食品中蛋白質定量檢測分為五種：一是營養功能性蛋白質的定量，主要指各種動物或人母乳的乳白蛋白，血清蛋白，乳鐵蛋白等；二是食品過敏性蛋白質的定量與產品標識，以植物性的花生、大豆、木瓜、堅果和動物的牛奶，甲殼動物，魚和蝦等；三是食品中不同來源蛋白質的定性與定量，包括羊奶制品中其他動物奶的定性與定量，羊肉中狐貍肉的鑒別等；四是致病性微生物毒性蛋白質的定性與定量，主要有金黃色葡萄球菌腸毒素A，B和C1型以及肉毒素等；五是致毒蛋白質的定量，包括蘑菇和藻類毒素。關于大分子的研究歷程也由1980年代的基因組學、1990年代的蛋白質組學發展到21世紀的靶向蛋白質組學。
 

所謂的靶向蛋白質組學指的是把一個基因組表達的全套蛋白質或一個復雜的混合體系中特定的目標蛋白質進行精確的定量和鑒定的一門學科。靶向蛋白質組學的檢測對象是針對已確定的目標蛋白質，通過將已知的蛋白質組學數據庫與蛋白酶特異性酶切技術相結合，篩查和選擇適合的特異肽段，進而在三重四級桿質譜中運用選擇反應檢測(SRM)或多反應檢測模式(MRM)建立相應的定量檢測方法。
 

任一平指出，近年來，在乳品行業的食品安全事故頻發，例如三聚氰胺導致的“結石門”、劣質奶粉引起的“大頭娃娃”事件……因此，在GB 10765-2010食品安全國家標準嬰兒配方產品中規定，乳基嬰兒配方食品中乳清蛋白含量必須滿足“≥60%”的設定。在新國標第二法中，有5種(或3種)氨基酸判定法。其基本原理是將樣品通過鹽酸水解過濾后，與N-羥基琥珀酰亞胺-活性雜環氨基甲酸酯(AQC)衍生。衍生物用液相色譜儀分離、紫外檢測器檢測，分別測定出其中的五種氨基酸(胱氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸)的含量。根據乳清蛋白占乳蛋白60%時所對應的上述氨基酸的臨界值，綜合判定乳清蛋白占乳蛋白的含量是否達到60%。然后利用五種安吉全的測定值分別進行單項判定，最后，上述五種單項判定結果中以三種及三種以上相同的判定為最終判定結果。
 

在首次使用液相色譜—單四級桿質譜法進行研究時，由于沒有考慮熱變性的蛋白部分，導致他們的方案被否決。任一平和其團隊在此基礎上再次展開了研究。這次研究的主要內容集中在特異(指紋)肽段的尋找(蛋白質質譜數據庫的查詢與運用)、色譜和質譜條件的優化與確定(TQ的MRM的應用)、酶解條件的優化、特異肽段的特異性驗證與確認(Q-TOF的全掃描)、內標特異肽的設計與合成、同位素內標物的設計與合成以及方法學驗證與樣品檢測應用上。在會議上，任一現場就如何進行特異肽的確認、選擇內標的原則等做了詳細的闡述。
 

在通過與專家的討論后，最終肯定了乳清蛋白“高效液相色譜-質譜聯用法”的科學性、合理性和創新性。任一平指出，引入蛋白組學的概念是技術上的進步，它解決了熱變形蛋白的測定問題。由于此方法在技術層面較為先進，對實驗操作人員要求較高，專家建議起草人對方法操作步驟應進一步提高和完善，明確標準品信息以便推廣使用，理順標準中兩個方法的關系，提供數據驗證兩種方法測定結果的可比性，進一步核實轉化系數0.6。
 

在報告的最后，任一平對高效液相色譜-質譜聯用法進行了小結與展望：高效液相色譜-質譜聯用法依據蛋白組學分析的理念與數據庫，引入酶解、串聯質譜相結合，運用同位素標記短肽內標法定量，具有靈敏度高、準確度優，選擇性好的特點，已經成功地運用到乳制品中牛α-乳白蛋白含量的檢測，為原料的質量提高技術保障。同時適用于不同含量產品中牛α-乳白蛋白的檢測，為產品提供技術支持。

目前該方法已經成功運用于真假羊奶的鑒別與定量、貝塔酪蛋白變異體的定量、花生過敏原的殘留定量和母乳中微量蛋白的定量等。